1. 광학 현미경 (Optical Microscope, Light Microscope, Brightfield Microscope) 이란?
ㅇ 가시광선을 사용, 시료에 대해 렌즈를 통해 확대된 이미지를 관찰
ㅇ 관찰매개 : 빛 (가시광선)
ㅇ 파장 : 약 400~700 μm 정도의 가시광선
ㅇ 구성 : 광원,집속 렌즈,접안 렌즈,대물 렌즈,시료,반사경 등
ㅇ 배율 : 약 1,000배 정도
ㅇ 분해능 : 약 0.1 ㎛ 정도
ㅇ 굴절 : 빛이 렌즈 물질의 굴절률 차이에 의해 굴절시킴
ㅇ 관찰 모드 : 반사 모드, 투과 모드, 편광 모드, 위상차 모드, 형광 모드 등
ㅇ 관찰 환경 : 살아있는 세포도 관찰 가능
2. 광학 현미경의 구성 요소
ㅇ 광원 (Light Source)
- 현미경 하단에서, 빛을 만들어내는 장치
- 할로겐 램프, LED 등 다양한 광원이 사용됨
ㅇ 집속 렌즈 (Focusing Lens)
- 현미경 하단 광원으로부터 나온 빛을 집속시켜,
- 시료를 통과하는(쪼이는) 빛을 제공
ㅇ 대물 렌즈 (Objective) : (배율 및 초점거리)
- 시료 물체에 가장 가까운 렌즈 (짧은 초점거리)
- 1차 확대상을 제공
ㅇ 접안 렌즈, 대안 렌즈 (Eyepiece, Ocular Lens) : (최종 확대 및 배율 조정)
- 대물 렌즈가 만든 실상을 눈으로 보게 함
- 최종 배율(확대)을 결정하여, 최종 상을 제공
ㅇ 스테이지 (Stage)
- 시료를 놓는 부분으로, 미세 조정 기능 포함
3. 광학 현미경의 성능 지표
ㅇ 배율 (Magnification)
- 확대 배율 : 대물 렌즈 (1~100배), 접안 렌즈 (5~20배)
. 대물 렌즈는, 횡배율로 상을 확대시키고,
. 접안 렌즈는, 각배율로 시야각을 증대시킴
- 종합 배율 : (대물렌즈 배율) x (접안렌즈 배율) (~2,000배)
* 배율이 높을수록, 상이 흐려짐
ㅇ 분해능 (Resolution Power)
- 사용 파장 : 약 400~700 μm 정도의 가시광선
- 분해능 : R ≒ 0.61λ/NA = 0.61λ/(n sinθ)
. 여기서, NA = n sin θ : 개구수 [무차원]
- 결국,
. 파장(λ)이 짧을수록, 렌즈의 크기(NA)가 커질수록, 공간 분해능이 좋아짐
. 통상, 분해능 수치가 작을수록 성능이 좋아지며, 그만큼 기기 가격도 높아짐
ㅇ 대비 (Contrast)
- 시료 내 지역(구획)별 차이를 강조시키는 것 (구별/식별이 가능케 함)
. 주로, 염색에 의함
.. 착색기법 또는 이른바 암시야 조명과 같은 특별한 조명 기법 등이 동원됨
4. 광학 현미경의 관찰법
ㅇ 현미경 관찰이 가능하려면,
- 광선의 투과성 확보
. 시료를 얇은 절편으로 만들어야 함
- 절편화
. 손으로 직접 자르는 방법 : hand section
. 영구표본제작방법 : microtome
.. 파라핀을 침투시키고 굳힌 다음 파라핀과 함께 절단하는 방법
ㅇ 관찰 준비 과정
- 표면 준비 : 절단,고정,탈수,염색,투명화,커버보호 등으로 미세구조를 드러나게 함
- 조명 조절 : 적절한 조명과 광원 설정을 통해 최적의 관찰 조건을 맞춤
- 초점 조정 : 시료,렌즈 간 거리 조정으로 관찰자 눈에 선명한 이미지를 형성시킴
5. 광학 현미경의 종류
ㅇ 일반 광학 현미경
- 가시광선을 이용해 물체를 확대 관찰 가능한 가장 기본적인 현미경
- 원리 : 대물 렌즈에서 상을 획득하고, 접안 렌즈를 통해 확대하여, 눈으로 관찰
- 특징
. 배율은 대물 렌즈와 접안 렌즈의 배율을 곱한 값
. 사용이 간단하고 다양한 시료를 관찰 가능
- 분해능 : 약 200nm 보다 작은 것은, 가시광선의 파장 한계에 영향을 받음
ㅇ 암시야 현미경 (ultramicroscope, Dark-Field Microscope)
- 암시야 조명 방식을 이용하여, 투명한 시료에서 산란되는 빛을 관찰하는 현미경
- 원리 : 시료 주변의 직접 광선을 차단하고 산란된 빛만 관찰
- 특징
. 배경이 어둡고 시료가 밝게 보이는 형태.
. 투명한 시료나 매우 작은 입자(콜로이드 등) 관찰에 유용
- 용도 : 세균, 미생물 및 세포의 관찰, 작은 입자 분석, 나노 물질 연구 등
ㅇ 간섭 현미경 (interference microscope)
- 빛의 간섭 현상을 이용하여 시료의 미세 구조를 강조하는 현미경
- 원리 : 두 개의 빛이 시료에서 간섭하여 위상 차이를 강조함으로써 구조를 관찰
- 특징
. 시료의 높이 차이나 굴절률 차이를 정량적으로 측정 가능
. 고 해상도 및 고 대비 이미지를 제공
- 용도 : 생체 시료(세포 내 구조) 관찰, 반도체 표면, 박막, 마이크로칩의 굴절률 분석 등
ㅇ 위상차 현미경 (phase-contrast microscope)
- 위상차를 이용하여 투명하고 색깔이 없는 시료의 세부 구조를 관찰하는 현미경
. 대비를 생성하는 데, 간섭 현상을 이용
- 원리 : 시료를 통과하는 빛의 위상 변화를 강조하여 시료의 구조를 가시화
- 특징
. 별도의 염색 과정 없이 투명한 시료를 관찰 가능.
. 위상판(Phase Plate)을 사용하여 빛의 위상을 차별적으로 강조
- 용도 : 세포의 내부 구조, 미생물, 무색의 조직 관찰, 살아있는 세포 관찰 등
ㅇ 편광 현미경 (polarized microscope)
- 대비를 생성하는 데, 평면 편광 조명을 사용
. (편광기를 통과시켜 단일 평면에서 만 진동하는 빛을 생성함)
- 반사광(불투명)과 투과광(투명) 모두에서 사용 가능
- 원리 : 이방성 물질이 편광된 빛의 조사 방향에 따라, 그 특성이 달라지는 현상을 이용
- 용도
. 암석/광물 유형을 식별하는 광물학의 표준 방법
. 이방성 특성을 나타내는 치아,뼈와 같은 단단한 조직
, 식물 세포벽의 셀룰로오스 섬유에서 분자 정렬이 높은 것을 관찰하는 등
* [참고] ☞ 편광, 편광기, 광학적 이방성 참조